PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）?是一種在體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。其基本原理是模擬DNA的自然復(fù)制過程，在體外利用DNA聚合酶實現(xiàn)DNA的快速擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系包括：

• ?模板?：待擴(kuò)增的核酸片段。

• ?引物?：人工合成的寡核苷酸，用于啟動DNA合成。

• ?dNTPs?：四種脫氧單核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。

• ?DNA聚合酶?：如Taq酶，在高溫下保持活性，催化反應(yīng)的完成。

• ?Mg2?：穩(wěn)定DNA聚合酶的活性。

PCR反應(yīng)原理
PCR的基本原理是基于DNA的變性、退火和延伸三個步驟的循環(huán)過程：

1. ?變性?：通過加熱使雙鏈DNA解開成為兩條單鏈，溫度通常在95℃左右。

2. ?退火?：降低溫度至55-70℃，使引物與單鏈DNA模板上的互補(bǔ)序列結(jié)合。

3. ?延伸?：在適宜的溫度下（72℃左右），DNA聚合酶以引物為起點，合成新的DNA鏈。

這三個步驟構(gòu)成一個循環(huán)，每完成一個循環(huán)，DNA的數(shù)量就會翻倍。經(jīng)過多次循環(huán)，可以獲得大量的目標(biāo)DNA片段?。

建立一個成熟穩(wěn)定的PCR反應(yīng)所需要的條件：
完整且純凈的模板（膠圖和nanodrop測值評價）
高特異高品質(zhì)的引物（引物設(shè)計軟件評分）
組分搭配適宜的反應(yīng)體系（比如針對模板的GC比，是否考慮添加DMSO或甜菜堿；高保真或高得率應(yīng)添加多少鎂離子）
合理的擴(kuò)增反應(yīng)程序（在引物Tm值附近進(jìn)行多次實驗摸索最佳退火溫度）

確定合理的擴(kuò)增反應(yīng)程序與PCR儀直接相關(guān)。如果PCR儀具備溫度梯度功能，則可以通過設(shè)置不同的溫度梯度來降低實驗次數(shù)，快速確定退火溫度。

柏恒梯度PCR儀（RePure系列）具備多種溫度梯度功能，助力您的PCR實驗：
常規(guī)梯度：單向的首尾兩端設(shè)定退火溫度范圍的低值和高值，中間孔位則漸進(jìn)分布溫度，但首尾之間的孔位不一定呈現(xiàn)等差溫度分布。

線性梯度：單向的中間設(shè)定一個溫度，再設(shè)定一個相鄰孔位的溫差，設(shè)定溫度會按照溫差向兩邊擴(kuò)散。相鄰孔位的溫度嚴(yán)格按照溫差生成，可驗證所感興趣的整數(shù)溫度?？v向生成4個（8孔），橫向生成6個（12孔）。國產(chǎn)品牌只有柏恒具備此功能。
線性梯度優(yōu)勢：同時進(jìn)行多個不同退火溫度的PCR反應(yīng)，一次實驗就能確定體系的退火溫度，縮短驗證周期提高實驗效率。

二維梯度：反應(yīng)模塊的縱向、橫向可以同時設(shè)置常規(guī)/線性梯度。使反應(yīng)模塊形成一個變性/退火均在不同溫度下反應(yīng)的陣列，通過一次反應(yīng)摸索出最佳的變性/退火溫度組合。
二維梯度優(yōu)勢：（1） 提高PCR反應(yīng)的特異性在二維梯度溫度下，引物與模板結(jié)合能力的變化，可以使反應(yīng)具有更高的特異性并減少非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)生。（2） 提高PCR反應(yīng)的產(chǎn)物純度通過對反應(yīng)中各分子靶點進(jìn)行優(yōu)化，以使放大的DNA產(chǎn)物得到放大。（3） 檢測基因點突變根據(jù)已知的突變位點設(shè)計適當(dāng)?shù)囊铮ㄟ^PCR擴(kuò)增得到目標(biāo)基因的片段，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，檢測突變位點。（4） 檢測種群間的遺傳多樣性通過二維梯度PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)突變位點，比對種群間的遺傳物質(zhì)多樣性。（5） 操作簡單二維梯度PCR僅僅需要配置一個反應(yīng)體系即可。（6） 提高陽性檢測準(zhǔn)確性二維梯度PCR一次性就可得到96種溫度組合，大大減免了樣品簡單的交叉污染，降低了假陽性出現(xiàn)的幾率，進(jìn)而提高了真陽性的檢測準(zhǔn)確性。（7） 縮短實驗時間由于二維梯度PCR可以根據(jù)溫度的不同，優(yōu)化出最佳反應(yīng)溫度，縮短了多次探索變性溫度或者退火溫度的時間。

獨立6溫區(qū)：相鄰溫區(qū)可設(shè)置溫差不超過5℃的溫度同時進(jìn)行退火溫度的摸索，每個溫度分區(qū)下有16孔可作為復(fù)孔位。獨立的6個溫度分區(qū)可以按照等差設(shè)置溫度也可根據(jù)需要靈活設(shè)置每個分區(qū)的溫度。相當(dāng)于線性梯度的升級版。

同時，柏恒梯度PCR儀均采用前進(jìn)風(fēng)后出風(fēng)的散熱模式，即便多臺PCR儀并排放置或在臺架上密集擺放，也不會因旁邊儀器的散熱風(fēng)影響控溫的準(zhǔn)確性。