前段時間和大家分享了PCR反應(yīng)的過程控制，今天來聊聊PCR的操作手法。實(shí)操可以說是整個PCR實(shí)驗(yàn)流程中最容易被忽略卻又至關(guān)重要的一環(huán)。

下面小編就來分享一下自己當(dāng)初的一些經(jīng)驗(yàn)心得，僅代表個人看法。

先說體系配置（各組分分開，非預(yù)混液）。配置前先計(jì)算好所需要的各組分體積，統(tǒng)一配置好后再進(jìn)行分裝。有的同學(xué)可能會心疼試劑，獨(dú)愛單孔配置方式……但對于實(shí)驗(yàn)來說，一次即可順利獲取有效結(jié)果才是最大的節(jié)約。在體系的配置時需注意一下各組分的添加順序：先加ddH₂O,其余組分再按體積大小依次加入。排液時，吸頭扎入液面以下排液，排出液體后嚴(yán)禁原處反復(fù)吸打潤洗槍頭（引物、酶、模板尤其需要注意）。吸頭有一定的吸附性，液體被排出后，如在原處潤洗組分會被反吸回吸頭，經(jīng)過三五次的潤洗可能會使目標(biāo)組分有嚴(yán)重的損失。如果想將吸頭內(nèi)的組分充分轉(zhuǎn)移，換個位置去潤洗吸頭。體系混勻也需注意，可以用合適量程的移液器緩慢吹打5-10次，也可以緩慢上下顛倒混勻；如果需要用渦旋振蕩器混勻的話，轉(zhuǎn)速盡量控制在600rpm以下，轉(zhuǎn)速過快的話對酶的損傷較大，低拷貝模板的曲線是否起跳差異會比較明顯。體系分裝到pcr反應(yīng)管時，移液器保持“吸一打一"的操作，不易生成氣泡。

再說實(shí)驗(yàn)環(huán)境。老生常談的要在超凈工作臺內(nèi)配置反應(yīng)體系，生物安全柜內(nèi)添加模板。超凈臺內(nèi)，按照常規(guī)操作不會有太大問題；生物安全柜可是氣溶膠污染的重災(zāi)區(qū)。生物安全柜內(nèi)氣溶膠主要來源于加樣后的棄吸頭，生物安全柜內(nèi)以循環(huán)風(fēng)為主，棄吸頭內(nèi)的殘留模板很容易會隨循環(huán)風(fēng)彌漫整個安全柜的內(nèi)環(huán)境，所以每次實(shí)驗(yàn)完都需要及時把棄吸頭打包好取出安全柜。尤其遇到中午沒有完成整個實(shí)驗(yàn)下午還要繼續(xù)爆肝的情況，一定要把垃圾桶內(nèi)的棄槍頭清理干凈，如果沒有人使用的話就擦拭后進(jìn)行紫外照射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的臺面清理及紫外消殺均屬基操，但需切實(shí)落實(shí)到位。

最后分享一下復(fù)孔實(shí)驗(yàn)如何操作可以提高曲線的成束性。配置反應(yīng)復(fù)孔時，可以參照統(tǒng)一配置體系的操作，將所有反應(yīng)孔的模板和體系混和好再逐孔分裝。這樣可以有效降低跳孔的風(fēng)險。如果是低拷貝擴(kuò)增（Ct值33以后曲線起跳），就不推薦模板混入反應(yīng)體系再分裝了，此時還是老老實(shí)實(shí)的逐孔加入模板更為穩(wěn)妥（泊松分布影響明顯）。

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